谷氨酸(glutamic acid，Glu)含量測(cè)定試劑盒說明書

                                 微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

Glu廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，不僅是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一，而且通過轉(zhuǎn)氨基作用參與多種氨基酸合成，是生物體內(nèi)主要氨基來源之一。此外，Glu還是味精的主要有效成分，常用做食品添加劑以及香料生產(chǎn)。

測(cè)定原理：

利用專用提取液提取，然后用顯色劑進(jìn)行顯色，顯色后在570nm下進(jìn)行測(cè)定。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶， 4℃保存；臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解混勻，用不完的試劑仍 4℃保存。

谷氨酸提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞樣品：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液樣品：按照血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液體積（mL）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）或者細(xì)胞培養(yǎng)液加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   在有蓋EP管中加入下列試劑：

混勻，90℃水浴20min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，于570nm波長(zhǎng)處記錄吸光值A。△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管。

谷氨酸含量計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0074x- 0.5255；x為谷氨酸含量（µg/mL），y為吸光值。

2、按照血清（漿）或者細(xì)胞培養(yǎng)液體積計(jì)算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2）=1351×(△A+0.5255)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

谷氨酸含量(µg/g鮮重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=135.1×(△A+0.5255) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

谷氨酸含量(μg/10⁴ cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(500×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0037x- 0.5255； x為谷氨酸含量（µg/mL），y為吸光值。

2、按照血清（漿）或者細(xì)胞培養(yǎng)液體積計(jì)算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0037×V1]÷(V3×V1÷V2）=2703×(△A+0.5255)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(V1×Cpr)=270.3×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

谷氨酸含量(µg/g鮮重)= [(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.3×(△A+0.5255) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

谷氨酸含量(μg/10⁴ cell)=[(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(500×V1÷V2)=0.541×(△A+0.5255)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

注 意：

1、該試劑盒僅適用于發(fā)酵液或組織中谷氨酸含量測(cè)定，檢測(cè)下限為100µg/mL。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：100µg/mL -600µg/mL。

3、ΔA線性范圍為：0.01-1；若大于1則需要將上清液用試劑一稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。