谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）試劑盒說(shuō)明書

                                              微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

GST是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。GST是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分，主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與GSH的巰基共價(jià)結(jié)合，使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì)，易于從膽汁或尿液中排泄，達(dá)到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的。因此，GST在保護(hù)細(xì)胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。此外，因?yàn)?/span>GST具有GSH-Px活性，亦稱為non-Se GSH-Px，具有修復(fù)氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質(zhì)等的功能。注意，GST催化的反應(yīng)減少GSH含量，但是不增加GSSG含量。

測(cè)定原理：

GST催化GSH與CDNB結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長(zhǎng)為340nm；通過(guò)測(cè)定340nm波長(zhǎng)處吸光度上升速率，即可計(jì)算出GST活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體22mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2 mL蒸餾水溶解。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.  血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三放在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）保溫。

3. 測(cè)定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20μL上清液，180μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光度變化，記錄10 s和310 s吸光度為A1和A2。

GST活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=230×(A2-A1) ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣品每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/g 鮮重）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=230×(A2-A1)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/10⁴ cell）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=230×(A2-A1) ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反總÷V樣÷T

                   = 230×(A2-A1)

ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×10³ L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V反總：反應(yīng)體系總體積，220μL=2.2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=460×(A2-A1) ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣品每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/g 鮮重）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=460×(A2-A1)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/10⁴ cell）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=460×(A2-A1)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol/L CDNB與GSH結(jié)合為1個(gè)酶活單位。

GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×10⁹×V反總÷V樣÷T

                   =460×(A2-A1)

ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×10³ L/mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V反總：反應(yīng)體系總體積，220μL=2.2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V

樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5min。

注意事項(xiàng)：

1. 樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力；

2. 細(xì)胞中GST活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中GST的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞；

3. 本法測(cè)定GST活性的線性范圍可達(dá)76 μmol/min /L，測(cè)定前先用1～2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如5min內(nèi)反應(yīng)不成線性，須對(duì)樣品用蒸餾水稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；

4. 測(cè)定反映的溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，請(qǐng)控制在25℃或者37℃（哺乳動(dòng)物）。