硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxin reductase, TrxR）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                  微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

TrxR是一種NADPH依賴(lài)的包含FAD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及NADPH共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR與GR活性類(lèi)似，催化GSSG還原生成GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。

測(cè)定原理：

TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNB和NADP⁺，TNB在412 nm有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定412nm波長(zhǎng)處TNB的增加速率，即可計(jì)算TrxR活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、可調(diào)節(jié)移液器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水溶解。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.  血清等液體：直接測(cè)定。

TrxR測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412nm，用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）預(yù)熱30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，160μL試劑一，迅速混勻后于412 nm測(cè)定10 s和310 s吸光度，記為A1和A2。△A空白管=A2-A1。

4. 測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，140μL試劑一，20μL上清液，迅速混勻后于412 nm測(cè)定10 s和310 s吸光度，記為A3和A4。△A測(cè)定管=A4-A3。

注意：空白管只需測(cè)定一次。

TrxR活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 147×（△A測(cè)定管-△A空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A測(cè)定管-△A空白管）÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

= 147×（△A測(cè)定管-△A空白管）

ε：TNB在412nm處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5 min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 294×（△A測(cè)定管-△A空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 294×（△A測(cè)定管-△A空白管）÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 294×（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A測(cè)定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

= 294×（△A測(cè)定管-△A空白管）

ε：TNB在412nm處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μ mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；W ：樣品質(zhì)量；V樣：

加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5 min。

注意事項(xiàng)：

1.        測(cè)定前須先取1～2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，哺乳動(dòng)物組織及血液制品TrxR活力測(cè)定時(shí)，一般須用蒸餾水稀釋5倍左右；測(cè)定過(guò)程操作須迅速。

2.        試劑二和試劑三配制好后3天內(nèi)使用完。