脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）含量測定試劑盒說明書

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

AsA作為植物細(xì)胞一個重要生理指標(biāo)，其AsA 的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關(guān)酶類活性的變化涉及植物對一系列環(huán)境脅迫的響應(yīng)。DHA是AsA的可逆的氧化型，在生物體內(nèi)，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng)，具有電子受體的作用。

測定原理：

DTT還原DHA生成AsA，通過測定體系中AsA的生成速率，即可計算出DHA含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100 mL×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體16mL×1瓶，室溫保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加入5.743 mL蒸餾水充分溶解；吸取0.1 mL上述溶液，加入0.9 mL蒸餾水，混勻，即為100μmol/L DHA。

樣品中DHA提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；12000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

DHA測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到265 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液、160μL預(yù)熱的試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A空白管=A2-A1。

4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL上清液、160μL預(yù)熱的試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A3和A4，△A測定管=A4-A3。

注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

DHA(nmol/mg prot) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷（Cpr×V樣）

=100×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

DHA(nmol/mL) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷V樣

=100×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管

C標(biāo)準(zhǔn)液：100μmol/L；V樣總：上清液總體積，1.0 mL=1 ×10^-3 L；V標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

DHA(nmol/mg prot) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷（Cpr×V樣）

=100×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

DHA(nmol/mL) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷V樣

=100×△A測定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管

C標(biāo)準(zhǔn)液：100μmol/L；V樣總：上清液總體積，1.0 mL=1×10^-3 L；V標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）。

注意事項：

1.        臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存，3天內(nèi)使用完。

2.        Z低檢出限為10μmol/L。