二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）試劑盒說明書

                                                     微量法100T/48S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動(dòng)物（腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛，其活性與核酸和蛋白合成密切相關(guān)，能夠反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度。

測(cè)定原理：

DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成氧化型鄰聯(lián)茴香胺，在460nm處有特征吸收峰，通過測(cè)定該波長(zhǎng)吸光度增加速率，計(jì)算DAO活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體0.3mL×1支，4℃保存。

試劑二：液體2.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體1.2mL×1管，4℃保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定操作表：

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至460nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表

酶活性計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18×A₄₆₀÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 18×A₄₆₀÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/10⁴cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T= 18×A₄₆₀÷細(xì)胞數(shù)量

(4) 按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 18×A₄₆₀

ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 36×A₄₆₀÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 36×A₄₆₀÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/10⁴cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T= 36×A₄₆₀÷細(xì)胞數(shù)量

(4) 按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 36×A₄₆₀

ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L /mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

注意事項(xiàng)：

1、如果OD值小于0.01，適當(dāng)加大提取用樣本量；OD值大于0.8，粗酶液可適當(dāng)稀釋，或者減少提取用樣本量。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。