禽腺病毒C種4型(FADV-C-4)熒光PCR試劑盒

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽腺病毒C種4型(FADV-C-4)熒光PCR試劑盒

Name ：Avian adenovirus C type 4 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

禽腺病毒 C 種 4 型(Avian adenovirus C type 4 , FADV-C-4)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，為雙鏈 DNA 病毒，分為 3 個(gè)群。自 2013 年，國內(nèi)雞群由禽腺病毒（FADV）引起的包涵體肝炎、心包積液病例逐漸增多[1]。而到 2015 年，高致病性血清４型 FADV 引起的肝炎－心包積綜合癥已在國內(nèi)雞群爆發(fā)，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2-3]。

本試劑盒適用于檢測的禽類動(dòng)物肺、脾、腦等組織、呼吸道分泌物、全血等標(biāo)本中禽腺病毒 C 種 4 型 DNA， 適用于禽腺病毒 C 種 4 型感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用一對禽腺病毒 C 種 4 型特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光PCR 技術(shù)對禽腺病毒 C 種 4 型病毒 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

1） 不同批號試劑不能混用。

2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取肺、脾、腦等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于 1mL50%甘油生理鹽水中；用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.   樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)/剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；全血樣品待血凝后取血清 100μL，置于 1.5mL 離心管中。

1.2  核酸提取

推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取/或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請按    照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.   試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.   加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，

短暫離心。

4.   PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1  將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.   質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

7.   檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7. 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項(xiàng)】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 趙繼勛.Ⅰ群禽腺病毒感染的流行病學(xué)探究與防控認(rèn)識[J]. 北方牧業(yè), 2017(6): 18.

[2] 楚電峰, 劉相娥, 薄智勇, 等.Ⅰ群禽腺病毒的流行病學(xué)和防控研究現(xiàn)狀[J]. 中國動(dòng)物檢疫, 2017,34(5): 86-89.

[3] 王亞楠, 韓濤, 李純玲, 等. 禽腺病毒Ⅰ群的研究現(xiàn)狀[J]. 中國動(dòng)物保健, 2017, 19(1): 61-64.