艱難梭狀芽孢桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：艱難梭狀芽孢桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Clostridium Difficile Probe PCR Kit

艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)屬厭氧性細(xì)菌，一般寄生在人的腸道內(nèi)。如果過度服用某些抗生素，艱難梭菌的菌群生長速度加快，影響腸道中其他細(xì)菌，引發(fā)炎癥。該細(xì)菌會引起偽膜性腸炎，臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、伴有全身中毒癥狀，癥狀突然開始，并伴隨血壓低，嚴(yán)重時能致死。通常還伴有發(fā)燒，白細(xì)胞增多，之后可導(dǎo)致死亡，是很嚴(yán)重的一類疾病。該細(xì)菌還會引起抗生素相關(guān)性腹瀉，在體內(nèi)的潛伏期為5-10天，之后導(dǎo)致大量的棕色或水狀腹瀉，持續(xù)1周左右。除上述疾病外，艱難梭菌尚可引起腎盂腎炎、腦膜炎、腹腔及陰道感染、菌血癥和氣性壞疽等。近年來該菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的病原菌之一，日益被人們所重視，因此快速檢測艱難梭狀芽孢桿菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測艱難梭狀芽孢桿菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)人艱難梭狀芽孢桿菌高度保守的VP1區(qū)設(shè)計(jì)，不會跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

【自備試劑】樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.       標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.      用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.      在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.      換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.      換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.      重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7.      如果有N個樣品，最好設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.       用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)細(xì)菌DNA/提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.      如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。

10.       在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

五、數(shù)據(jù)處理

     12.     以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

六、電泳檢測

     13.      如果有必要電泳確認(rèn)，可取10-20μL PCR產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，建議不輕易采納。