支原體通用熒光探針法PCR定量檢測試劑盒

產品名稱：支原體通用熒光探針法PCR定量檢測試劑盒

英文名稱：Mycoplasmaspp.Probe qPCR Kit

支原體和親緣關系很近的無膽甾原體、螺旋體統稱霉形體。霉形體是目前發現的最小的、Z簡單的原核生物。它們缺乏細胞壁、有變形能力、能通過濾菌器、  可在無生命培養基中生長繁殖，成為細胞培養中常見的一種污染源，嚴重影響細胞生長率、細胞形態、基因表達、細胞代謝和細胞活力。因此快速靈敏檢測支原體具有重要意義。本產品就是為此目的根據 PCR 原理開發的試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經過優化，靈敏性高。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據支原體高度保守區設計，不會跟其他微生物的 DNA 發生交叉反應。

5.本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

6.本產品只能用于科研。

【試劑組成】

【自備試劑】樣品 RNA。

【注意事項】

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1.  標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用

5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數細菌 DNA/提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的細菌 DNAout 或柱式細菌 DNAout。本試劑盒免費贈送 20 次免 DNA 提取的核酸釋放劑，本產品的裂解液可以直接作為 PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。其使用手冊可向本公司客服索取。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：

四、數據處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。