組織無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

無(wú)機(jī)磷主要指磷酸根，參與生物體內(nèi)多種代謝，包括能量代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化等等，此外促進(jìn)碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運(yùn)。

測(cè)定原理：

鉬藍(lán)與磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定660nm光吸收，即可計(jì)算無(wú)機(jī)磷含量。

自備儀器和用品：

離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前配制，加入10 mL蒸餾水，充分溶解后加入試劑二（全部），混勻。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支。

無(wú)機(jī)磷提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.打開(kāi)水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度到40℃。

3. 空白管：取0.5mL EP管，依次加入100μL蒸餾水，100μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10 min后于660 nm測(cè)定吸光度，記為A空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5mL EP管，依次加入10μL標(biāo)準(zhǔn)液，90μL蒸餾水，100μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10 min后于660 nm測(cè)定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

5. 測(cè)定管：取0.5mL EP管，依次加入10μL上清液，90μL蒸餾水，100μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10 min后于660 nm測(cè)定吸光度，記為A測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

組織無(wú)機(jī)磷含量計(jì)算：

（1）         按照蛋白含量計(jì)算

無(wú)機(jī)磷含量(μmol/mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷Cpr

=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷Cpr

(2)  按照樣本質(zhì)量計(jì)算

無(wú)機(jī)磷含量(μmol/g 鮮重 )= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷W

=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：1mmol/L；V總：上清液總體積，1mL=0.001 L；W：樣品質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

1.        試劑三需臨用前配制，并且當(dāng)天使用完畢。

2.        40min內(nèi)完成比色。

3.        Z低檢出限為10μmol/L。