單胺氧化酶（Monoamine Oxidase，MAO）試劑盒說明書

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎動物的各種器官，特別是分泌腺、腦、肝臟，在無脊椎動物、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質(zhì)代謝，含量較低，具有重要的生理功能，其活性能反映肝纖維化的程度。此外，MAO活性異常導致細胞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)運轉出現(xiàn)紊亂，從而引發(fā)多種病癥。

測定原理：

MAO催化單胺類底物脫氨生成相應的醛，進一步氧化成酸；底物在360nm處有特征吸收峰，測定360nm光吸收下降的速率，計算MAO活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1管，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1.        稱取約0.1g樣品，加1 mL預冷的提取液一充分冰浴勻漿，1000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉移到另一預冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1mL預冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預冷的1mL 試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測定）。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉移到另一預冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1.0 mL預冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預冷的1.0 mL 試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測定），取上清置于冰上待測。

3.        血清：直接測定。

測定操作表：

1、   分光光度計/酶標儀預熱30min，調(diào)節(jié)波長至360nm。

2、   操作表

注意：空白管只需測定一次。

MAO活性計算公式：

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、按蛋白含量計算

酶活定義：37℃，pH7.6時，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)轉化1 nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO活性（nmol/min / mg prot）= ×V反總÷（V樣× Cpr）÷T= 114×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算：

酶活定義：37℃，pH7.6時，每克樣品1min內(nèi)轉化1 nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO活性（nmol/min / g 鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T = 114×ΔA÷ W

3、按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃，pH7.6時，每104個細胞1min內(nèi)轉化1 nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO活性（nmol/min / 104 cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量）÷T

= 114×ΔA÷細胞數(shù)量

4、按照液體體積計算

酶活定義：37℃，pH7.6時，每升血清1min內(nèi)轉化1 nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO活性（nmol/min /L）=×V反總÷V樣=114×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)，1460L /mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，60min，W：樣本質(zhì)量，g

b．用96孔板測定的計算公式如下

1、按蛋白含量計算

酶活定義：37℃，pH7.6時，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)轉化1 nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO活性（nmol/min / mg prot）= ×V反總÷（V樣× Cpr）÷T= 228×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算：

酶活定義：37℃，pH7.6時，每克樣品1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO活性（nmol/min / g 鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T = 228×ΔA÷ W

3、按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃，pH7.6時，每104個細胞1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO活性（nmol/min / 104 cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量）÷T

= 228×ΔA÷細胞數(shù)量

4、   按照液體體積計算

酶活定義：37℃，pH7.6時，每升血清1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO活性（nmol/min /L）=×V反總÷V樣=228000×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)，1460L /mol /cm； d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，60min，W：樣本質(zhì)量，g

注意事項：

1、吸光度變化應該控制在0.01～0.8之間。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計算公式中參與計算的稀釋倍數(shù)要相應改變。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測定。